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文章标题《骨肉瘤中GRM4基因表达和启动子甲基化的研究及其研究意义》

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研究背景：骨肉瘤是zui常见的原发性恶性骨肿瘤。对于那些在诊断的时候没有发生转移的患者,

其5年生存率可达70%。尽管取得了许多进展,然而其余的有转移的或者对化疗不敏感的骨肉瘤患

者,其5年生存率只有20%左右。骨肉瘤的真正病因尚不清楚,其发生发展过程是一个包括环境因

素和遗传因素的多因素过程。表观遗传学的研究进展表明,表观遗传改变可引起骨肉瘤的恶

性转化和进展,让我们可以更好地了解这种肿瘤的分子机制。代谢型谷氨酸受体4(mGluR4)主要

是突触前谷氨酸受体,其在控制运动的基底神经节环路的数个关键位置表达,参与突触前兴奋性

谷氨酸信号的神经传递。研究表明代谢型谷氨酸受体4(mGluR4)在多种肿瘤中表达并与其进组预

后相关,在成骨细胞和破骨细胞中mGluR4的表达表明谷氨酸信号参与骨形成和骨吸收过程中的细

胞分化与调控。目的：研究表明在骨肉瘤中代谢型谷氨酸受体4(mGluR4)呈高表达状态。本研究

检测63例骨肉瘤患者的骨组织和105例非肿瘤患者的骨组织中GRM4基因启动子甲基化状态以及表

达情况,探讨GRM4基因启动子甲基化与其表达的关联及其在骨肉瘤中的研究意义。方法：研究对

象及标本：收集2010年1月-2012年7月期间在广西医科大学*附属医院诊疗的骨肉瘤患者组织

标本63例。所有患者术前未进行相关抗癌治疗措施,所有标本经过病理学检查确认为骨肉瘤。取

得的标本在切除后立即置入液氮罐冷冻保存,然后转到-80℃条件下低温保存。取得105例非肿瘤

患者的骨组织作为对照组,同样经液氮冷冻低温保存,后转到-80℃低温冰箱保存用于基因甲基

化、RNA和蛋白测定。并且收集患者的研究和组织学资料,如年龄、性别、Enneking分期、转

移、肿瘤部位、组织学类型。所有患者均进行随访,术后前2年内每2个月进行1次随访,在接下来

的随访过程中每6个月随访一次,平均随访时间为20个月(1月-36月)。这项研究由广西医科大学

附属*医院伦理委员会批准,每一位患者在告知的情况下签署知情同意书。GRM4基因启动子甲

基化的测定：通过焦磷酸测序的方法检测骨肉瘤组织及非肿瘤患者的骨组织中GRM4基因启动子

的甲基化状态。GRM4基因mRNA表达的测定：通过RT-PCR的方法测定骨肉瘤组织及非肿瘤患者的

骨组织中GRM4基因的mRNA水平的表达。GRM4基因蛋白表达的测定：通过Western Blot(WB)的方

法测定骨肉瘤组织及非肿瘤患者的骨组织中GRM4基因的蛋白水平的表达。统计学分析：应用

SPSS 16(IBM,Armonk,NY,USA)进行统计分析。采用独立样本t检验来比较骨肉瘤组织和癌旁组织

的甲基化水平、基因表达和蛋白表达的差异。用斯皮尔曼相关性(Spearman correlation)检测

GRM4基因甲基化和基因表达之间的相关性。GRM 4甲基化水平与研究病理特征(包括年龄,性别,

阶段,外科分期,病理组织学类型,位置,和转移)之间的关系则用卡方检验或Fisher确切概率法。

应用Kaplan-Meier分析和Log-rank检验分析骨肉瘤患者的总生存期(OS)、无复发生存率(RFS)和

无进展生存期(PFS),其中需要排除在末次随访仍然存活的患者。P值<0.05,被认为有统计学意

义。结果：在骨肉瘤组织及非肿瘤患者的骨组织中GRM4基因启动子甲基化的情：通过焦磷酸测

序的方法检测GRM4基因启动子甲基化状态。在骨肉瘤组织及非肿瘤患者的骨组织中平均甲基化

水平分别是3.79±0.83%和4.08±0.74%,其中P<0.05。这说明相对于非肿瘤患者的骨组织而言,

在骨肉瘤组织中GRM4基因启动子表现为低甲基化。在骨肉瘤组织及非肿瘤患者的骨组织中GRM4

mRNA水平的表达情况：用RT-PCR的方法检测骨肉瘤组织及非肿瘤患者的骨组织中GRM4 mRNA水平

的表达情况。在骨肉瘤组织中GRM4 mRNA的灰度值为1.71±0.15,而在正常骨组织中其值为

0.56±0.13,P<0.05,有统计学意义。其结果表明与非肿瘤患者的骨组织中相比,在骨肉瘤组织中

GRM4mRNA呈现高表达。在骨肉瘤组织及非肿瘤患者的骨组织中GRM4蛋白水平的表达情况：用免

疫印迹分析方法(WB)的方法检测骨肉瘤组织及非肿瘤患者的骨组织中GRM4蛋白水平的表达情

况。在骨肉瘤组织中的值为1.28±0.08,而在正常骨组织中其值为0.35±0.05,P<0.05,有统计学

意义。其结果表明与非肿瘤患者的骨组织中相比,在骨肉瘤组织中GRM4蛋白呈现高表达。